PEWARNAAN GRAM

IDENTIFIKASI MIKROBA METODE PEWARNAAN GRAM

Mengapa Mikroba Perlu Diidentifikasi ?

      Mikroorganisme merupakan makhluk hidup yang berukuran beberapa mikron atau lebih kecil lagi. Bakteri, kapang, khamir, hewan bersel satu protozoa, dan virus tergolong dalam mikroorganisme karena ukurannya yang kecil dengan jumlah yang paling banyak. Hal ini disebabkan kemampuannya yang sangat cepat untuk berkembang biak. Mikroorganisme dapat diamati secara langsung dan tidak langsung dengan mikroskop.

      Bakteri dapat diperoleh dari mana saja, misalnya dari rongga mulut, sela-sela gigi, dari tanah yang banyak sampahnya, dan dari sisa-sisa makanan yang sudah basi. Bakteri mempunyai bentuk dasar bulat, batang, dan melengkung. Bentuk bakteri juga dapat dipengaruhi oleh umur dan syarat pertumbuhan tertentu. Bakteri dapat mengalami involusi, yaitu perubahan bentuk yang disebabkan faktor makanan, suhu dan lingkungan yang kurang menguntungkan bagi bakteri.  (Sumarsih, 2003).

      Identifikasi mikroba dilakukan untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri dengan mengamati bakteri secara langsung atau di dalam kondisi hidup ataupun dalam keadaan mati serta mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan mikroskop.  Identifikasi mikroba terhadap morfologinya ini perlu untuk mengenal nama bakteri. Selain itu, identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram diperlukan untuk pengenalan sifat-sifat fisiologi bakteri sebagai faktor penentu dalam mengenal nama spesies suatu bakteri (Dwijoseputro, 2005).

      Terdapat 2 cara untuk mengamati bakteri dengan mikroskop, yaitu mengamati sel mikroba yang masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati sel mikroba yang telah mati dengan diwarnai. Bakteri lebih mudah dilihat ketika diwarnai dengan zat warna. Zat warna yang digunakan untuk melihat bakteri juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel bakteri. Adanya pewarnaan pada bakteri yang mempunyai sel sangat kecil akan lebih mudah terlihat dibawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif yang mempunyai tingkat pembesaran yang relatif tinggi.

      Salah satu metode identifikasi mikroba adalah metode pewarnaan Gram. Bakteri yang diwarnai dengan pewarnaan Gram terbagi dua golongan, yaitu Gram positif, bila warna zat pewarna pertama (kristal violet) tetap bertahan dengan demikian warna bakteri tampak ungu tua, sedangkan pada Gram negatif, yaitu apabila warna zat warna pertama tida bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misalnya safranin, air fuchin, dan zat pewarna tandingan lainnya(Razali, 1987).

Apa saja yang dibutuhkan dalam identifikasi mikroba ?

      Alat-alat yang digunakan dalam percobaan identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram, yaitu tabung reaksi, pipet tabung, kaca preparat, kaca objektif, gegep kayu, bunsen, tabung mini, mikroskop cahaya, erlenmeyer, pinset.

      Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram, yaitu kultur mikroba Lactobacillus casei, safranin, kristal violet, iodin, alkohol, aquades, tissue.

Bagaimana cara identifikasi mikroba ?

      Alat-alat dan bahan di persiapkan. Sterilisasi secara kimiawi dilakukan pada alat dan meja kerja. Kaca preparat difiksasi, kemudian koloni mikroba digoreskan di atas kaca preparat menggunakan jarum ose. Setelah itu, difiksasi dan ditambahkan 3 tetes kristal violet dan diamkan selama ± 30 detik, kemudian bilas dengan aquades lalu difiksasi. Selanjutnya ditambahkan 3 tetes iodin dan diamkan selama ± 30 detik, kemudian dibilas dengan aquades. Selanjutnya ditetesi alkohol, lalu dibilas lagi dengan aquades dan difiksasi. Kemudian ditambahkan beberapa tetes safranin, kemudian dibilas dengan aquades, setelah itu difiksasi kembali. Selanjutnya diamati menggunakan mikroskop cahaya.

Gambar Pengamatan Pewarnaan Gram  Sel Lactobacillus casei.

Bagaimana Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Negatif ?

       Berdasarkan penyusun dinding selnya, bakteri terbagi menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah jenis bakteri yang dapat mempertahankan zat warna kristal violet, sehingga sel bakteri yang diamati akan tampak berwarna ungu pada mikroskop. Dinding sel bakteri Gram positif terdiri atas 30 peptidoglikan dan hanya meliputi ± 30-40 % bakteri kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun dinding sel Gram positif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan asam teikoat yang sangat spesifik. Bakteri Gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dibilas dengan alkohol, dan ketika diberi pewarna tandingannya yaitu zat warna safranin akan tampak berwarna merah. Hal ini sebabkan karena bakteri Gram negatif memiliki dinding sel yang terdiri atas satu sampai dua lapis rangka peptidoglikan, dan hanya meliputi ± 10 % dari berat kering dinding sel. Hal ini sesuai dengan pernyataan Suriawiria (1999) bahwa bakteri Gram positif adalah bakteri yang tetap berwarna ungun setelah dicuci dengan alkohol dan Karmana (2008)  bahwa bakteri Gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet dan tampak berwarna merah setelah penambahan safranin.

Apa yang dimaksud bakteri Lactobacillus casei ?

      Lactobacillus casei  merupakan salah satu jenis bakteri asam laktat homofermentatif (sebagian besar hasil akhirnya merupakan asam laktat) yang sedikit atau tidak menghasilkan CO₂. Sesuai morfologinya, L. Casei berbentuk batang pendek dalam koloni tunggal maupun berantai. Bakteri ini bersifat gram positif, katalase negatif, tidak membentuk endospora maupun kapsul, tidak mempunyai flagela dan tumbuh dengan baik pada kondisi anaerob fakultatif.  Lactobacillus casei  adalah bakteri yang bisa memecah protein, karbohidrat, lemak dalam makanan, menolong penyerapan elemen penting dan nutrisi seperti asama amino, dan vitamin yang dibutuhkan manusia dan hewan untuk bertahan hidup. Lactobacillus casei mampu menghambat pertumbuhan bakter-bakteri patogen peyebab infeksi saluran pencernaan seperti E. Coli dan Salmonella sp karena dapat menhasilkan H₂O₂ dan bakteorisin. Hal ini sesuai dengan pernyataan Pato (2003), bahwa Lactobacillus casei  sebagai bakteri asam laktat adalah kolompok bakteri Gram positif berbentuk bulat atau batang, tidak membentuk spora, yang memproduksi asam laktat sebagai produk akhir metabolik utama selama fermentasi karbohidrat.

Apa yang dimaksud dengan Metode Pewarnaan Gram ?

       Salah satu metode identifikasi mikroba adalah pewarnaan Gram dimana bakteri diamati dengan zat warna. Pewarnaan bertujuan untuk memudahkan melihat ukuran, bentuk, dan struktur sel bakteri.  Bakteri yang diwarnai dengan pewarnaan gram terbagi dua golongan, yaitu Gram positif, bila warna zat pewarna pertama (kristal violet) tetap bertahan, dengan demikian warna bakteri tampak ungu tua. dan bakteri disebut Gram negatif apabila warna zat warna pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, yaitu safranin. Hal ini sesuai dengan pernyataan Pelczar & Chan (2007) bahwa pewarnaan Gram bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola.

Bagaimana mekanisme kerja Kristal Violet ?

      Kristal violet berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid  kristal violet. Kristal violet bersifat basa mampu berikatan dengan mikroorganisme yang bersifat asam. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel bakteri Gram  ngatif menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap mempertahankan warna biru, sedangkan dinding sel bakteri gram positif terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori-pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga berwarna ungu. Hal ini sesuai dengan pernyataan sesuai dengan pernyataan Pelczer dan Chan (2007) bahwa bakteri Gram positif akan mempertahankan zat warna kristal violet, adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya.

Bagaimana mekanisme kerja Iodin?

      Pewarnaan iodin berfunsfi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg- Ribonuclead acid. Tujuan penambahan iodin adalah untuk memperkuat pengikatan pewarna primer oleh bakteri. Warna ungu pada bakteri Gram positif disebabkan karena bakteri tersebut mengikat kompleks zat warna kristal ungu dengan iodin, dan terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma bakteri Gram positif. zat warna akan lebih jelas terlihat setelah penambahan larutan iodin dan zat warna akan lebih sulit dilarutkan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Pelczar dan Chan (2007) yang menyatakan bahwa iodine yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-Ribonuclead acid.

Bagaimana mekanisme kerja Alkohol ?

      Alkohol sebagai solven organik berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada  sel bakter. Pemberian alkohol pada pewarnaan ini mengakibatkan bakteri akan tetap berwarna ungu pada bakteri Gram positif karena mengandung peptidoglikan. Bakteri Gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga kompleks kristal ungu dan iodin keluar dari sel dan tetap berwarna ungu. Alkohol yang diteteskan pada bakteri akan melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari kompleks kristal violet dengan iodin pada Gram negatif karena mengandung lipid. Lipid tereksitasi (keluar) dari dinding sel dan pori-porinya mengembang sehingga kompleks kristal violet dan iodin keluar dari sel. Hal ini sesuai dengan pernyataan Karmana (2008) bahwa bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu setelah dicuci dengan alkohol, sedangkan bakteri Gram negatif menjadi tidak berwarna setelah ditambahkan alkohol.

Bagaimana mekanisme kerja Safranin ?

      Safranin berfungsi sebagai zat warna tandingan yang dapat melunturkan kompleks mg-Ribonuclead acid- kristal violet dari diniding sel bakteri Gram negatif. Penambahan safranin pada bakteri Gram negatif menyebabkan sel bakteri berwarna merah. Fungsi safranin sebagai pembeda (kontras) terhadap warna kristal violet-iodium dalam pewarnaan Gram. Hal ini sesuai pernyataan Pelczar dan Chan (2007) bahwa safranin berfungsi sebagai zat warna tandingan (lawan) meluruhkan kompleks mg-Ribonuclead acid- kristal violet dari diniding sel bakteri gram negatif.

Apa fungsi dari Aquades ?

Fungsi aquades dalam metode pewarnaan Gram untuk melunturkan warna utama yaitu kristal violet sehingga dapat memperjelas pengamatan. Aquades ditambahkan ketika proses pewarnaan atau setelah penambahan zat warna untuk melunturkan sisa-sisa larutan pewarnaan gram agar tidak ada zat warna yang mempengaruhi identifikasi mikroba. Penambahan aquades dilakukan dengan cara membilas bakteri pada kaca preparat. Hal ini sesuai dengan pernyataan Wahyuningsih (2008) bahwa pencucian dengan aquades dimaksudkan untuk meluruhkan zat warna pada bakteri.

Apa fungsi dai Fiksasi ?

Fiksasi dilakukan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada kaca preparat tanpa merusak struktur sel bakteri. Fikasi dilakukan dengan melewatkan secara cepat kaca preparat di api. Fiksasi panas atau dikeringkan dengan bunsen agar bakteri dapat menempel pada kaca sehingga pada saat pencucian bakteri tidak akan terhapus. Hal ini sesuai dengan pernyataan Lay (1994) bahwa fiksasi adalah metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pembakaran dengan tujuan untuk mematikan mikroba dan melekatkan sel mikroba pada objek gelas tanpa merusak struktur selnya.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta : Djambatan

Karmana, Oman. 2008. Bioloigi. Jakarta : PT Grafindo Media Pratama.

Lay,B.W. 1994. Analisa Mikroba di Laboratorium  Edisi I . Jakarta : PT. Raja Grafindo Persada.

Pato, Usman. 2003. Potensi Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Dadih Untuk Menurunkan Resiko Penyakit Kanker. Jurnal Natur Indonesia vol 5 (2): 162-166. ISSN 1419-9379.

Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Razali, U. 1987. Mikrobiologi dasar.  Jatinagor : UNPAD.

Sumarsih, Sri. 2003. Mikrobiologi Dasar. Yogyakarta : UPN “ VETERAN”.

Suriawiria, U. 1999.  Mikrobiologi. Jakarta: CV Rajawal

Wahyuningsih.2008. Pengecatan Gram.  Purwokerto : Universitas Jenderal Soedirman.